«Выживаемость возрастает в десятки раз»

Бактерии и нападающие на них бактериофаги.

Российские ученые приблизились к разгадке механизма «обучения» генома бактерий, по которому у них возникает иммунитет к вирусам. О том, как изучали необычный «недарвиновский» иммунитет бактерий, рассказывает один из авторов работы, аспирант Института молекулярной генетики РАН Антон Тихонов.

─ В чем важность исследований иммунитета бактерий, которые проводились в вашей работе?

─ Работа посвящена новой недавно открытой системе антивирусной защиты бактерий – CRISPR/cas. То, что она существует и является именно системой иммунной защиты, стало известно только лет шесть-семь назад. Это очень новая популярная тема, ей занимаются многие лаборатории по всему миру. Эта система интересна тем, что работает по ламаркианским механизмам наследования: появление наследуемого признака непосредственно вызвано внешней средой. То есть

изменения происходят не в ходе случайного процесса мутаций «по Дарвину», из которых потом отбираются полезные, а при направленном воздействии среды – «по Ламарку». Это очень важный и необычный механизм «обучения» генома.

─ Как работает эта система?

─ Cистема состоит из CRISPR кассеты и cas-генов. CRISPR кассета – это участок ДНК, представляющий собой набор из уникальных коротких последовательностей в 20–30 пар азотистых оснований длиной (так называемые спейсеры), которые разделены повторяющимися последовательностями. Рядом с CRISPR кассетой находятся cas-гены, которые кодируют белки, необходимые для работы всей системы. Последовательности спейсеров, которые разделены повторами, совпадают с последовательностями в ДНК фагов или плазмид – внешних генетических угроз бактерии. Система способна узнавать последовательности ДНК угрожающих факторов, если они совпадают с последовательностью одного из спейсеров CRISPR-кассеты.

Если такая ДНК распознана, соответствующие белки бактерии нападают на нее и уничтожают. В чем здесь ламаркианские черты? Спейсеры, которые запускают процесс уничтожения фага, берутся из самой последовательности фага. То есть ДНК бактерии изменяется не случайным, а направленным образом.

Когда бактерия встречает нового фага, она вставляет небольшой кусочек фаговой ДНК в CRISPR кассету и за счет этого «записывает» данные о нем в своей ДНК, использует их для защиты от таких фагов и затем передает этот приобретенный защитный механизм по наследству.

Процесс встраивания участка чужеродной ДНК в CRISPR кассету называется адаптацией. Это пример очень направленного генетического изменения. Однако четко механизм работы этой системы пока неизвестен.

─ То есть ваша работа заполняет «белые пятна» в этой проблеме?

─ Интенсивные исследования в этой области привели к тому, что сейчас ученым в целом понятно, как работает система защиты, каким образом узнается участок ДНК в фаге и как уничтожается фаговая ДНК. Однако вопрос, за счет чего набираются новые спейсеры, как происходит адаптация, оставался открытым. В нашей работе, опубликованной в журнале Nature Communications, мы подошли к ответу на этот вопрос. С помощью косвенных методов мы получили важные указания на то, что молекулярная машина, которая отвечает за узнавание и уничтожение фаговой ДНК, при определенных условиях включает процесс набора спейсеров из фаговой ДНК в CRISPR кассету.

─ Каким образом?

─ Предположим, что есть фаг, данные о котором бактерия уже записала в свою CRISPR кассету. Что ему нужно сделать, чтобы все-таки заразить ее? Нужна мутация в участке ДНК, который соответствует спейсеру CRISPR кассеты бактерии. Тогда молекулярная машина не сможет найти соответствующий участок ДНК и разрушить фаг. Мы показали, что это не совсем так. Хотя молекулярная машина и не может уничтожить фаговую ДНК в этом случае, она узнает фаговую ДНК и привлечет белки, которые осуществляют процесс адаптации.

Экспериментальный факт такой: если клетки заразить фагом, ДНК которого не полностью соответствует спейсеру в CRISPR кассете клетки (но все же является схожей), то адаптация в такой системе происходит на два порядка более эффективно, чем если заразить клетки совершенно неизвестным им фагом.

Рис. 1. Предполагаемый механизм работы CRISPR/cas системы в E. coli и механизм праймирования //Екатерина Семенова.

Наши данные позволяют предположить, что процесс адаптации происходит следующим образом. Большая молекулярная машина, состоящая из нескольких cas-белков и РНК спейсера CRISPR кассеты, узнает последовательность ДНК в фаге и связывается с ним. Если последовательность в фаговой ДНК идентична последовательности РНК спейсера (а значит, и совпадает с последовательностью этого спейсера в геноме), то молекулярная машина привлекает специальный cas-белок, которые разрезает фаговую ДНК. Но если идентичность участка фаговой ДНК и РНК спейсера не полная, то молекулярная машина привлекает другие cas-белки, которые вырезают из фаговой ДНК новый спейсер, который затем вставляется в CRISPR кассету бактерии. Процесс был назван праймингом. Пока эта красивая схема – лишь спекуляция о механизме адаптации, но мы получили экспериментальный «намек» на этот механизм – он показывает, в какую сторону надо «копать». Мы, конечно, уже ведем работы в этом направлении.

─ Как вы определяете эффективность адаптации бактериальных клеток?

─ У нас есть данные о генетике исходной популяции. Затем мы заражаем ее фагом, ждем какое-то время и затем секвенируем ДНК выживших клеток. Таким образом

мы смотрим, какие произошли изменения в CRISPR-кассетах, соотносим их с известными нам данными о ДНК фагов и делаем вывод о том, каким образом бактерии выжили, приспособились к новой угрозе.

Эти данные мы сравниваем с данными контрольного эксперимента, проведенного с фагами, ДНК которых были полностью неизвестны бактерии. Это позволяет нам сказать, что произошло с популяцией.

В наших экспериментах оказалось, что если мы заражаем бактерии совершенно незнакомым фагом, то лишь три процента выживших бактерий удлиняют свою CRISPR-кассету на один спейсер, соответствующий новому фагу, то есть приспосабливаются к этой угрозе среды за счет «ламаркианского» механизма CRISPR адаптации. А если мы заражаем бактерии фагом, обладающим кусочком ДНК, похожим на CRISPR спейсеры бактерии, от 50% до 90% популяции набирает в CRISPR кассеты спейсеры из последовательности фага. То есть адаптация в таком случае идет гораздо эффективнее, выживаемость возрастает в десятки раз.

─ Как удалось набрести на эту мысль?

─ Отчасти случайно, как это иногда бывает в науке. Мы проводили эксперименты с приспособляемостью бактерий, и идея была протестировать клеточную культуру на заведомо незнакомом фаге.

Однако по ошибке один из соавторов работы налил в чашку с бактериями как раз фаги, отчасти известные бактериям, то есть те фаги, которые несут последовательности ДНК, очень похожие на спейсеры CRISPR кассеты.

После завершения эксперимента, опять же не зная о закравшейся ошибке, мы проанализировали ДНК выживших клеток. Оказалось, что эффективность адаптации неожиданно высока. Стали разбираться в причинах, ошибка была найдена, и уже тогда эффект начали изучать более направленно.

Источник(и):

1. gazeta.ru

http://www.nanonewsnet.ru/articles/2012/vyzhivaemost-vozrastaet-v-desyatki-raz